Ukončené granty:

  • Studium funkce membránových proteinů

    Grantová agentura: GAUK
    Identifikační číslo grantu: GAUK 456213
    Hlavní řešitel: Mgr. Jakub Zahumenský, Ph.D.
    Spoluřešitelé: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc.

    Annotace grantu

    Hlavní náplní projektu je podrobné a systematické studium membránových transportérů u kvasinek Saccharomyces cerevisiae, jejich funkce a reakce na chemický stres v různých podmínkách. Předmětem studia budou především proteiny mnohočetné lékové rezistence (MDR) Pdr10 a Pdr15 a plazmatická H+-ATPáza (Pma1). Zejména budou zkoumány možnosti a způsoby její aktivace a inhibice.
    Pozornost bude také věnována studiu transportérů, které nejsou nativní kvasince S. cerevisiae, ale mohou být v této kvasince (heterologně) exprimovány, zejména Cdr1 a Cdr2 – MDR proteiny nativní kvasince Candida albicans (rezistence kvasinkových infekcí a kontaminací) [1, 2].
    Chemický stres bude představován látkami používanými v medicíně nebo zemědělství – např. antibiotiky, cytostatiky apod.. Proteiny budou studovány v intaktních kvasinkových buňkách především metodou barvících křivek [3] za využití redistribuční potenciometrické fluorescenční sondy diS-C3(3), která je zároveň substrátem dvou významných kvasinkových MDR pump (Pdr5, Snq2) [4].
    Kvasinkové MDR proteiny jsou odpovědné za vysokou rezistenci infekcí a kontaminací. Zároveň jsou vysoce homologní s lidskými MDR proteiny, které například zvyšují rezistenci rakovinných buněk vůči chemoterapii. Základní strukturní a funkční organizace kvasinkových buněk je shodná s buňkami vyšších eukaryot [5]. Z těchto důvodů mohou mít výsledky projektu praktický význam i v oblasti medicíny.
    Reference:

  • Studium mnohočetné lékové rezistence u kvasinek Kluyveromyces lactis

    Grantová agentura: GAUK
    Identifikační číslo grantu: GAUK 1072313
    Hlavní řešitel: Mgr. Iva Jančíková, Ph.D.
    Spoluřešitelé: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc.

    Annotace grantu

    Při léčbě některých typů onemocnění (např. rakovinných) byla zaznamenána snížená účinnost léčivých látek jako důsledek vyvinuté rezistence buněk. To je mj. způsobeno tím, že v buněčných membránách se vyskytují transportéry, které aktivně odstraňují široké spektrum léčivých látek ven z buněk. Jejich nadprodukce vede ke vzniku tzv. mnohočetné lékové rezistence (MultiDrug Resistance, MDR). Tyto proteiny (pumpy) se vyskytují u všech typů buněk. Mezi nejlépe prostudované MDR pumpy eukaryotních organismů patří Pdr5p u kvasinky Saccharomyces cerevisiae a P-glykoprotein u lidských buněk.
    V rámci tohoto projektu se chceme zaměřit na studium homologního transportéru Pdr5p u kvasinek rodu Kluyveromyces, konkrétně Kluyveromyces lactis (využívaný též v potravinářském průmyslu při výrobě sýrů), který je však podstatně méně prozkoumán než S. cerevisiae. Pro charakterizaci této pumpy (ozn. Kl Pdr5p) použijeme fluorescenční metodu, která byla vyvinuta pro studium aktivity dvou hlavních MDR pump u S. cerevisiae, Pdr5p a Snq2p. Metoda je založena na sledování rozdílu v akumulaci potenciometrické fluorescenční sondy diS-C3(3) v buňkách s různou aktivitou pump, které sondu z buněk odstraňují (sonda je jejich substrátem).
    Úspěšné zavedení fluorescenční metody pro studium pumpy Kl Pdr5p nám umožní sledovat faktory ovlivňující její aktivitu, včetně vyhledávání účinných inhibitorů, a porovnat aktivitu Pdr5p u obou druhů kvasinek (Saccharomyces vs. Kluyveromyces).

  • Biofyzikální metoda sledování změn membránového potenciálu a aktivity systémů mnohačetné lékové rezistence kvasinek

    Grantová agentura: GAČR
    Identifikační číslo grantu: GACR 205/10/1121
    Hlavní řešitel: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc.

    Annotace grantu

    Navrhovaný projekt se skládá ze dvou rovnocenných částí s fyzikálními a biologickými dílčími cíli. Hlavním cílem fyzikální části projektu je zdokonalení fluorescenční metody monitorování aktivity MDR pump kvasinek, která byla vyvinuta v naší laboratoři. Nová metoda by měla umožnit a) přímé kvantitativní stanovení akumulace fluorescenčních substrátů MDR pump v buňkách, b) rychlou identifikaci inhibitorů MDR pump, c) sledování kinetiky procesů aktivace a inhibice MDR systémů. Hlavní cíle biologické části projektu se týkají využití jak původní, tak zdokonalené metody monitorování aktivity MDR pump při a) charakterizování vlivu různých chemických stresorů na membránový potenciál i aktivitu kvasinkových MDR pump závislých na ATP, b) stanovení substrátové specifity MDR pump kvasinek S. cerevisiae pro vybrané stresory, c) stanovení vlivu narušení funkce MDR pump na vitalitu a přežívání kvasinek a bakterií.

  • Studium vlivu exogenního chemického stresu na procesy v membráně kvasinek pomocí fluorescenčních sond

    Grantová agentura: GAUK
    Identifikační číslo grantu: GAUK 135109
    Hlavní řešitel: RNDr. Andrea Drietomská
    Spoluřešitelé: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc.

    Annotace grantu

    Hlavní náplní projektu je studium mechanizmů činnosti membránových transportérů v intaktních buňkách kvasinek Saccharomyces cerevisiae a jejich odpověď na chemický stres. Pozornost bude věnována především a) MDR pumpám (Multidrug resistance pumps), což jsou transportní proteiny zodpovědné za rezistenci buněk vůči širokému spektru látek, mj. i mnoha léků, b)H+-ATPáze, protonové pumpě, která kontrojule důležité fyziologické procesy uvnitř buňky. Chemický stres budou představovat látky užívané v medicíně nebo v zemědělství, jako např. antibiotika, cytostatika, fungicidy a protonofory. Bude porovnán vliv struktury různých analogů vybraného chemického stresoru/stresorů na aktivitu membránových transportérů. Dále bude stanoven vliv zvoleného stresu na buňky v závislosti na různých podmínkách (stáří kultury, zdroj uhlíku, koncentrace stresorů, atd.), a bude určeno, jestli dochází k inhibici, aktivaci nebo inaktivaci membránových transportérů, případně k poškození membránové struktury. Odpověď buněk na stres bude sledována především pomocí fluorescenční metody založené na použití redistribuční potenciometrické fluorescenční sondy diS-C3(3), která je zároveň susbtrátem dvou významných MDR pump v kvasinkách. Vzhledem k podobnosti kvasinkových MDR pump s membránovými proteiny živočichů či patogenních mikroorganismů (zodpovědnými za rezistenci k antibiotikům, cytostatikům atd.), mohou mít výsledky i praktický význam v oblasti medicíny, ochrany životního prostředí nebo zemědělství.

  • Použití molekulárních sond pro studium vlivu stresových faktorů na činnost mikrobiálních membránových transportních systémů

    Grantová agentura: GAUK
    Identifikační číslo grantu: GAUK 67407
    Hlavní řešitel: RNDr. Marie Kodedová, Ph.D.
    Spoluřešitelé: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc.

    Annotace grantu

    Projekt je zaměřen na stanovení stresem indukovaných změn v činnosti membránových transportních systémů kvasinek a bakterií, zejména MDR pump zodpovědných mj. za rezistenci mikrobiálních patogenů vůči antibiotikům. Vliv bioaktivních látek/stresorů (lysozomotropní aminoestery, bispyridinaminy, imunomodulátory) na membránový potenciál a činnost MDR pump kvasinky Saccharomyces cerevisiae a bakterie Escheria coli bude stanoven v reálném čase analýzou fluorescenční odpovědi fluorescenční sondy diS-C3(3), která je substrátem těchto pump. Určí se, zda pozorovaná inhibice pump je kompetitivní, nebo zda zahrnuje inaktivaci pum. Fluorescenční mikroskopie (barvení calcofluorem a rhodamin-falloidinem) stanoví změny buněčné stěny a cytoskeletu vyvolané působením stresoru, proudová cytometrie bude použita pro sledování potenciálu na mitochondriální membráně kvasinek. Vliv chemického stresu na vitalitu a přežití buněk bude stanoven výsevovými testy, měřením respirace a acidifikační síly kvasinek, elastický rozptyl světla ukáže změny v agregačních vlastnostech a/nebo poškození kvasinkových buněk vyvolané stresory. Bude zavedeno rychlé poměrové vyhodnocení barvicích křivek a poměrová metoda bude zkalibrována. Budou provedeny srovnávací experimenty s jinými fluorescenčními sondami a vytvořeny experimentální protokoly pro nové fluorescenční (mnohabarevné) techniky. Bude porovnána činnost MDR pump kvasinek a bakterií rostoucích na pevných a v kapalných médiích a určen vliv složení kultivačního média kvasinek na membránový potenciál a aktivitu MDR pump.

  • Molekulární mechanismy buněčných interakcí

    Grantová agentura: GAČR
    Identifikační číslo grantu: GACR 204/03/H066
    Hlavní řešitel: doc. RNDr. Jitka Forstová, CSc.
    Spoluřešitelé: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc.

    Annotace grantu

    Cílem projektu je dosáhnout zvýšení vědecké kvality prací doktorského studijního programu i) rozšířením jejich myšlenkových a metodických přístupů o nekonvenční pohledy a řešení, jejichž inspirací často bývají diskuse na interdisciplinární úrovni ii) využitím “know-how” a přístrojových kapacit zúčastněných týmů pro potřeby vědecké výchovy. Uskupení 15 školitelů a 30 studentů (ze dvou fakult University Karlovy, VŠCHT, 4 ústavů AVČR a jednoho resortního ústavu Ministerstva zdravotnictví) vytvoří výzkumný rámec pro školení studentů v oborech molekulární, buněčné a vývojové biologie, biochemie, fyziky, virologie, mikrobiologie, parazitelogie a imunologie. Výzkumný rámec předkládaného projektu vznikl z komplementace zaměření týmů, studujících intra- i inter- buněčné interakce v průběhu i) diferenciace buněk, ii) komunikace mezi buňkami nebo buněčnými populacemi, iii) působení stresových faktorů na buňku (včetně infekce viry a jinými pathogeny).

  • MDR-pumpy v kvasinkách: kinetika, inhibice a role různých fyziologických podmínek; použití fluorescenční sondy Dis-C3(3)

    Grantová agentura: GAČR
    Identifikační číslo grantu: GAČR GP202/04/P110
    Hlavní řešitel: RNDr. Eva Urbánková, Ph.D.

    Annotace grantu

    Podstatou projektu je rozvoj unikátní fyzikální metody pro měření přerozdělování potenciometrické fluorescenční sondy Dis-C3(3) přes biologické membrány. Tato metoda bude použita pro studium aktivity membránových MDR-pump (Multi-Drug Resistance), jichž je použitá sonda substrátem. Tyto pumpy odstraňují celou řadu cizorodých látek z buněk, čímž způsobují mimo jiné i rezistenci mikrobiálních patogenů vůči antibiotikům. Jako modelový eukaryontní organismus budou použity kvasinky a jejich mutanty. AktivitaMDR pump bude studována u kvasinek rostoucích v tekutých médiích v závislosti na jejich růstové fázi a porovnána s kvasinkami pěstovanými na pevných půdách. Bude třeba přesně analyzovat a oddělit vliv membránového potenciálu od činnosti pump. Během projektu budou studovány různé inhibitory MDR-pump, které mají biomedicínský význam, neboť umožňují modifikovat buněčnou odpověď na antibiotika, desinfekční přípravky, atd.

  • Funkční charakterizace bakteriálních transportérů manganu závislých na protonovém gradientu (MntH) pomocí fluorescenčních metod

    Grantová agentura: MŠMT
    Identifikační číslo grantu: MSMT 1K04019
    Hlavní řešitel: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc.
    Spoluřešitelé: RNDr. Roman Chaloupka, Ph.D.

    Annotace grantu

    Jelikož rodina transportérů dvojmocných kovových iontů Nramp přispívá k rezistenci hostitele, zdá se, že funkční bakteriální homology Nramp (MntH) získané horizontálním genovým přenosem mohou být důležité v procesu patogeneze. Hlavním cílem předkládaného projektu je další vývoj a optimalizace citlivých fluorescenčních technik umožňujících studium transportu transportéry manganu závislými na protonovém gradientu (MntH) v živých bakteriích. Budeme studovat změny intracelulární koncentrace protonů a kovového substrátu vyvolané funkcí MntH transportérů pomocí zeleného fluorescenčního proteinu (GFP) citlivého na pH resp. vhodné fluorescenční sondy citlivé na přítomnost daného kovu. Tyto fluorescenční techniky budou použity ke studiu potenciálních vazebných míst v bakteriálních MntH transportérech, ke zkoumání možných evolučních změn rodiny proteinů Nramp a porovnání fylogenetických skupin MntH transportérů z hlediska jejich funkce.

  • Monitorování změn aktivity transmembránových MDR transportérů během růstu v kapalných médiích v závislosti na zdroji energie

    Grantová agentura: FRVŠ
    Identifikační číslo grantu: FRVS 555/2005
    Hlavní řešitel: RNDr. Jan Maláč
    Spoluřešitelé: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc.

    Annotace grantu

    S přispěním FRVŠ bylo vyřešeno: Studium metabolickými změnami indukovaných změn v aktivitě MDR pump vedlo ke zjištění, že komponenty vyčerpaného kultivačního média přímo neinhibují aktivitu MDR pump stejně jako neblokují jejich syntézu. Prokázali jsme, že pro resyntézu pump u postdiauxických, či stacionárních buněk je třeba dodat aminokyseliny. Dosažené výsledky jsou obsahem 2 publikací a 3 konferenčních příspěvků.

  • Vliv povrchových struktur mikrobiálních buněk na odezvu fluorescenčních sond: buněčná stěna kvasinek jako modelový systém

    Grantová agentura: GAČR
    Identifikační číslo grantu: GAČR GA202/00/D112
    Hlavní řešitel: RNDr. Roman Chaloupka, Ph.D.

    Annotace grantu

    Vývoj nových metod k měření membránového potenciálu je bezesporu velmi důležitý, protože membránový potenciál vypovídá nejen o stavu samotné plazmatické membrány, ale i o dalších procesech svázaných s transportem přes ni.

  • Role membrány při interakci buňky s exogenními proteiny: interakce kvasinkové plazmatické membrány se zymociny

    Grantová agentura: GAČR
    Identifikační číslo grantu: GACR 204/00/0629
    Hlavní řešitel: doc. RNDr. Blanka Janderová, CSc.
    Spoluřešitelé: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc., Ing. Karel Sigler, DrSc.

    Annotace grantu

    K základním buněčným funkcím patří mezibuněčná komunikace. Některé buňky vylučují hormony, mitogeny, atd., které způsobí u zasažených citlivých buněk změny v genové transkripci, fyziologii nebo diferenciaci. V těchto procesech hrají nezastupitelnou roli receptory lokalizované v cytoplasmatické membráně. Mezi receptory umožňujícími vstup látek letálních pro buňku patří receptory pro kvasinkové zymociny (killer toxiny). Cílem tohoto projektu je zjistit vlastnosti (specificitu, selektivitu) receptorů v plasmatické membráně Saccharomyces cerevisiae a mechanismus jejich interakce s killer toxiny. Konkrétně stanovíme: (1) specificitu receptorů v plasmatické membráně S. cerevisiae (zda jde o membránové lipidy či specializované proteinové entity sloužící jako receptory) (2) zda jde o jeden typ receptoru s variabilní specificitou nebo o několik subpopulací receptorů s odlišnými specificitami (3) možnost ovlivnit receptorové interakce mutagenními či jinými zásahy.

  • Další osud oxidačně poškozených membránových bílkovin životně důležitých pro eukaryontní buňku: H+-ATPasa plasmatické membrány kvasinek

    Grantová agentura: GAČR
    Identifikační číslo grantu: GAČR GA204/99/0488
    Hlavní řešitel: Ing. Karel Sigler, DrSc.

    Annotace grantu

    Reaktivní druhy kyslíku (ROS) jsou závažným faktorem podílejícícm se na vzniku mnoha chorob, na stárnutí, programované smrti buňky a apoptóze. Žádná dýchající buňka neunikne jejich účinku, protože 2-3 % respirovaného O2 se přemění na ROS. Plasmatická membrána je prvním cílem ROS vznikajících v okolním prostředí v důsledku přítomnosti zněčišťujících látek, UV záření, ozonu a dalších toxických látek. V projektu (1) stanovíme, jak oxidativní poškození životně důležitých membránových bílkovin ovlivní životní funkce buňky, (2) budeme definovat typy poškození nebo oxidativních změn postižených membránových bílkovin, (3) stanovíme další osud oxidativně změněných membránových bílkovin a (4) stanovíme způsoby, jimiž se proteolytický aparát buňky podílí na odstraňování těchto poškozených bílkovin. H2O2 a Fentonovo činidlo (Fe2+/H2O2) budou použity jako oxidanty a H+-ATPasa plasmatické membrány kvasinek jako model of oxidativně poškozené membránové bílkoviny.

  • Plasmatická membrána eukaryontní buňky jako zásahové místo pro stresové faktory prostředí

    Grantová agentura: MŠMT
    Identifikační číslo grantu: MSMT ME 315
    Hlavní řešitel: Ing. Karel Sigler, DrSc.

    Annotace grantu

    Stresové faktory prostředí vyvolávají primární změny plasmatické membrány živých buněk. Ty vedou sekundárně k chorobným změnám v buňkách rostlin, živočichů a lidí. Tyto změny jsou vyvolány z velké části kyslíkovými radikály indukovanými stresovými látkami. Projekt je zaměřen na interakci kyslíkových radikálů s P-ATPasami plasmatické membrány, které jsou životně důležité pro všechny eukaryontní buňky. Modelovým enzymem je H+-ATPasa plasmatické membrány kvasinek. Bude stanoveno, zda primárním mechanismem interakce je peroxidace lipidů, oxidace katalyzovaná kovy či neradikálová reakce, a budou určeny typy poškození enzymu (oxidativní modifikace postranních řetězců aminokyselin, fragmentace nebo agregace peptidové kostry proteinu). Působení oxidantu bude stanoveno v celých buňkách, v izolované membráně a v a rekonstituovaných váčcích z plasmatické membrány (PMV). Stres bude dále indukován toxiny, antibiotiky, ionofory a desinfekčními činidly.

  • Zellulare plasmamembran als angriffziel fur umweltstressfaktoren

    Grantová agentura:
    Identifikační číslo grantu: BMBF TSR-113-97
    Hlavní řešitel: Ing. Karel Sigler, DrSc.
    Spoluřešitelé: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc., Prof. Dr. Milan Höfer

    Annotace grantu

    není k dispozici

  • Role of electrochemical H+-gradient in maintaining eukaryotic cell membrane integrity under stress

    Grantová agentura:
    Identifikační číslo grantu: NATO CRG.CRGP 973150
    Hlavní řešitel: Ing. Karel Sigler, DrSc.
    Spoluřešitelé: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc., Prof. Dr. Milan Höfer

    Annotace grantu

    není k dispozici

  • Effect of oxidative stress on eukaryotic plasma membrane function

    Grantová agentura:
    Identifikační číslo grantu: NATO HTECH.LG930686
    Hlavní řešitel: Ing. Karel Sigler, DrSc.
    Spoluřešitelé: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc., Prof. Dr. Milan Höfer

    Annotace grantu

    není k dispozici

  • Ochranné mechanismy mikrobiální buňky proti působení stresových faktorů

    Grantová agentura: GAČR
    Identifikační číslo grantu: GACR 204/96/1261
    Hlavní řešitel: Ing. Karel Sigler, DrSc.

    Annotace grantu

    Bude stanovena úloha proteolytických složek buněk bacilů, zvláště proteázy ISP1, v osudu bílkovin změněných vlivem stresu a rozdíly mezi B. megaterium a B. subtilis v tomto ohledu. Bude charakterizován gen kódující ISP1 v B. megaterium a bude srovnán s obdobným genem v B. subtilis. Bude stanovena úloha vnitrobuněčného inhibitoru v posttranslační modifikaci ISP1 a zodpovězena otázka, zda syntéza mRNA je zodpovědná za zvýšené hladiny hsp (DnaK, GroEL, GroES) během sporulace. Budou charakterizovány funkčnía chemicky strukturní změny membránových bílkovin u S. cerevisiae a Sch. pombe H+ -ATPasa, H+ -symportery) způsobené kyslíkovými radikály a definována úloha peroxidace lipidů a oxidace katalyzované kovy při poškození bílkovin plasmatické membrány kvasin ek. Budou stanoveny styčné body mezi účinkem oxidativního, teplotního a dalších druhů stresu na membrány.

  • Vliv fyziologického stavu a membránové energizace citlivých buněk na průběh interakce kvasinek s killer toxinem K1: studium pomocí fluorescenčních sond

    Grantová agentura: GAUK
    Identifikační číslo grantu: GAUK 143/96/B-FYZ
    Hlavní řešitel: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc.

    Annotace grantu

    není k dispozici

  • Mechanismen der direkten und radikalvermittelten schadigung eukaryotischer plasmamembranproteine durch oxidativen stress

    Grantová agentura:
    Identifikační číslo grantu: Stiftung I/70 979
    Hlavní řešitel: Ing. Karel Sigler, DrSc.
    Spoluřešitelé: Prof. Dr. Milan Höfer

    Annotace grantu

    není k dispozici

  • Interakce exogenních proteinů s buněčnými povrchy: působení killer toxinu K1 na membránu kvasinek

    Grantová agentura: GAČR
    Identifikační číslo grantu: GACR 204/95/1051
    Hlavní řešitel: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc.

    Annotace grantu

    Na celých buňkách a rekonstituovaných váčcích z plasmatické membrány bude charakterizována integrace toxinu K1 produkovaného kompetentním kmenem kvasinek s membránovými receptory buněk citlivého kmene a následná tvorba membránových pórů. Budou stanoveny kinetické konstanty vazby, vliv protonmotorické síly, iontů Ca2+ a Mg2+ a osmotických stabilizátorů používaných při práci s protoplasty, vliv toxinu na uspořádánost membrány, membránovou H+ -ATPasu, toky K+ a větších molekul (ATP, leucin), a na velikost napadených buněk. Bude vypracována universálně použitelná metoda fluorescenčního stanovení membránového potenciálu u kvasinek. Projekt tvoří nezbytný základ pro stanovení dosud neznámého mechanismu interakce killer toxinu s kvasničnou buňkou, jako modelu interakce axogenních proteinů s buněčnými povrchy.

  • Vliv stresových faktorů na membránové funkce u bakterií a kvasinek

    Grantová agentura: GAČR
    Identifikační číslo grantu: GACR 204/93/2224
    Hlavní řešitel: Ing. Karel Sigler, DrSc.

    Annotace grantu

    Cílem projektu je analýza vlivu stresových faktorů prostředí (oxidanty, pH, teplota a osmotický šok) na modelové pro- a eukaryotické mikroorganismy, a jejich odpověď na stres pokud jde o buněčnou energetiku, funkce buněčné membrány a funkce stresových proteinů ze skupin GreEL a DnaK, a těch, které stimulují katabolismus bílkovin u stresovaných buněk, Na obou modelech bude důraz na vlivu stresu na lipidní matrici membrány, membránové energizační (H+-ATPasa) a trnasportní (H+-symportery aminokyselin a curů) proteiny, a na vlastní a stresem indukované iontové kanály. Vliv systémů indukujících či inhibujících stres bude zkoumán na celých buňkách a rekonstituovaných liposomech obsahujících fragmenty plasmatické membrány.